Las células estromales mesenquimales inmunomoduladoras derivadas del amnios preservan la función muscular en un modelo murino de distrofia muscular de Duchenne

Puntos principales y hallazgos:

Este es un estudio en animales. No se trató a ningún paciente. Un equipo japonés de la Universidad de Tokio, la Nippon Medical School y Kaneka Corporation administró células estromales mesenquimales derivadas del amnios humano (hAMSC) a ratones mdx, el modelo murino estándar de la distrofia muscular de Duchenne, mediante inyecciones repetidas en la vena de la cola, y siguió a los ratones durante hasta un año.

Para una familia que se plantea un tratamiento, el artículo muestra que estas células calman el sistema inmunitario en el laboratorio al orientar los macrófagos hacia el tipo antiinflamatorio M2, que los ratones toleraron las dosis intravenosas repetidas y que estas redujeron la inflamación muscular, y que los ratones tratados conservaron más fuerza de agarre, corrieron más lejos y tuvieron una función cardiaca ligeramente mejor al cabo de un año. No demuestra que nada de esto ocurra en niños. Las células procedían del amnios, no del cordón umbilical como las que se usan en nuestro propio programa, y no restauraron la distrofina, la proteína ausente que causa la enfermedad. Las células fueron suministradas por Kaneka Corporation, que financió en parte el trabajo y emplea a cuatro de los autores.

Objetivo:

Comprobar si las hAMSC orientan los macrófagos humanos hacia el tipo M2, y si la inyección sistémica repetida de hAMSC administrada al inicio de la enfermedad mejora la función del músculo esquelético y cardiaco en ratones mdx.

Métodos:

Células. Se obtuvo amnios, con consentimiento, de membranas fetales de mujeres sometidas a cesárea. Las células se aislaron mediante digestión enzimática, se expandieron, se congelaron y se usaron entre los pases 1 y 5. Presentaban los marcadores habituales de las MSC (CD73, CD90, CD105), carecían de CD45, CD34, CD14, CD11b, CD19 y HLA-DR, y formaron hueso y cartílago en cultivo, pero no grasa.

Trabajo de laboratorio. Se cocultivaron células mononucleares de sangre humana con hAMSC en proporción de 20 a 1 y se midieron los marcadores de macrófagos mediante citometría de flujo y qPCR, con indometacina para bloquear la prostaglandina E2 (PGE2).

Animales. Ratones mdx machos con fondo C57BL/10 se dividieron al azar en grupos de control y de tratamiento. Cada dosis fue de 8,0 × 10⁵ hAMSC en 100 µL de solución salina en la vena de la cola, una vez a la semana, a partir de las 4 a 5 semanas de edad. El brazo a corto plazo recibió cuatro dosis (n = 10, evaluados a las 12 y 18 semanas de edad, frente a 14 ratones mdx de control y 7 de tipo salvaje). El brazo a largo plazo recibió cuatro dosis (n = 6) o seis dosis (n = 4) y se evaluó al año frente a 12 ratones mdx de control y 7 de tipo salvaje. Muchos resultados se midieron en subconjuntos de 3 a 8 ratones, indicados más abajo. El criterio principal preespecificado fue la función motora a largo plazo (fuerza de agarre de las extremidades anteriores y velocidad de carrera); la histología fue secundaria. Los investigadores no podían estar cegados respecto a la cepa del ratón; la carrera se registró con una rueda automatizada durante cinco días. Se excluyeron datos cuando un ratón había perdido peso, estaba lesionado o debilitado, o cuando un valor se consideró peculiar.

Resultados:

Efectos inmunitarios in vitro. Las hAMSC redujeron la proliferación de linfocitos T activados del 90,1% al 59,9% (p inferior a 0,0001) y secretaron PGE2. La proporción de células CD206 positivas (M2) aumentó modestamente, del 11,3% al 14,2% (p = 0,035), mientras que las células M1 no cambiaron. La indometacina eliminó el aumento de CD206, lo que apunta a la PGE2 como mediador.

Tolerabilidad. El peso corporal no difirió entre los ratones mdx tratados y los no tratados en ningún momento. No se comunican otras medidas de seguridad (examen de órganos, detección de tumores, reacción inmunitaria a las células humanas).

A corto plazo (de 12 a 18 semanas de edad, cuatro dosis):

• La creatina cinasa sérica, el marcador de fuga muscular, fue menor cuatro semanas después de la última dosis (435 ± 79 frente a 583 ± 92 ng/mL, p = 0,038, n = 6 frente a 4), pero no a las diez semanas (582 frente a 700 ng/mL, p = 0,228). Los autores la califican de transitoria.
• IL-6 en el músculo tibial anterior: 10,0 ± 3,8 frente a 94,2 ± 64,1 pg/mL (p = 0,002, n = 4 frente a 5).
• Fuerza de agarre a las 12 semanas: 336,8 ± 21,0 g frente a 280,0 ± 37,8 g (p = 0,0008; normalizada al peso corporal 10,3 frente a 8,8 g/g, p = 0,012; n = 10 frente a 14).
• Área de macrófagos (F4/80) en el diafragma: 14,0% frente a 19,5% (p = 0,013, n = 4 frente a 3). La proporción de macrófagos con el marcador M2 CD206 en el tibial anterior aumentó del 17,6% al 55,5% (p inferior a 0,0001).
• Se encontraron células humanas en el tibial anterior cuatro semanas después del tratamiento, y ocupaban solo el 0,0036% del área de la sección; habían desaparecido a las diez semanas. No se detectó distrofina, por lo que las células no repararon el defecto de fondo.

A largo plazo (un año, cuatro o seis dosis, normalmente agrupadas):

• Infiltración de células mononucleares en el tibial anterior: 9,0% en los controles, 7,3% tras cuatro dosis, 4,7% tras seis; solo el grupo de seis dosis alcanzó la significación (p = 0,038, n = 4 por grupo tratado frente a 14). Sin diferencias en el diafragma.
• Fibras con núcleos centrales, un signo de degeneración y regeneración repetidas: 64,3% frente a 82,0% (p = 0,014, n = 5 frente a 7).
• La fibrosis no se redujo en el tibial anterior, el diafragma ni el corazón.
• Fuerza de agarre: 296,5 ± 27,2 g frente a 265,7 ± 26,3 g (p = 0,049; normalizada 8,6 frente a 7,3 g/g, p = 0,002; n = 8 frente a 12). Los ratones de tipo salvaje obtuvieron 336,4 g, de modo que los ratones tratados quedaron entre ambos.
• La velocidad máxima de carrera no fue diferente (21,6 frente a 20,5 m/min, p = 0,77). La distancia diaria recorrida fue mayor (3.649 ± 1.025 frente a 2.420 ± 788 m/día, p = 0,028, n = 8 frente a 10), al igual que la distancia media por minuto (18,3 frente a 14,7 m/min, p = 0,047, n = 5 frente a 5).
• Corazón: sin diferencias en la morfología macroscópica, la fibrosis ni la polarización de los macrófagos, pero menor infiltración de células mononucleares (n = 6 frente a 6) y mayor fracción de acortamiento del ventrículo izquierdo, 37,0 ± 2,3% frente a 33,6% (p = 0,017; tipo salvaje 39,6%). El encabezado de la Tabla 2 indica 8 ratones tratados, mientras que su nota al pie y la leyenda de la figura dicen 5, una incoherencia del propio artículo.

Conclusiones:

Los autores concluyen que el tratamiento sistémico temprano y repetido con hAMSC retrasó la inflamación y el deterioro motor en ratones mdx, probablemente mediante la polarización de los macrófagos hacia M2 y no porque las células se convirtieran en músculo. Sugieren que podría combinarse con esteroides o con terapia génica.

Limitaciones que indican los autores:

• La enfermedad cardiaca en los ratones mdx es leve en comparación con los pacientes, por lo que los hallazgos cardiacos aportan información limitada sobre los humanos. Proponen confirmarlo en el modelo canino.
• Las células humanas persistieron solo brevemente, y no está establecido cómo los factores secretados producen efectos duraderos; el mecanismo queda por esclarecer.
• El cultivo y la expansión prolongados de las MSC conllevan riesgos de senescencia y de cambios cromosómicos, y la capacidad inmunosupresora varía según el tejido de origen.
• Según los métodos: los investigadores no estaban cegados respecto a la cepa, algunos datos se excluyeron por criterio del investigador y los grupos a largo plazo eran pequeños.

Información de contexto:

La enfermedad de Duchenne afecta aproximadamente a 1 de cada 3.500 nacidos varones. Los esteroides son el tratamiento antiinflamatorio estándar, pero las respuestas varían y los efectos secundarios son frecuentes. El mismo equipo había comunicado antes que las células madre de pulpa dental por vía intravenosa repetida mantenían la actividad locomotora en ratones mdx y perros distróficos. Los autores señalan que las MSC administradas por vía intravenosa quedan en gran parte atrapadas en los pulmones y mueren allí, y que su efecto inmunitario parece proceder de cómo responden los propios fagocitos del receptor a las células moribundas. El artículo no contiene datos sobre células derivadas de cordón umbilical y no menciona ningún ensayo en humanos con células derivadas del amnios para la enfermedad de Duchenne.